PRINCIPALES TECHNIQUES D’ANALYSE DE L’ADN

RAPPEL SUR LE GENE ET SON EXPRESSION

L’ADN est présent dans toutes les cellules nucléées et sa séquence est identique dans toutes
les cellules d’un même organisme.
Il y a 12 picogrammes d’ADN par cellule. 1 ml de sang contient environ 5 millions de
leucocytes soit 60 mg d’ADN. Cette quantité est largement suffisante pour le diagnostic
moléculaire et parfois pour des études de recherche.

L’analyse de l’ADN est un moyen de diagnostic utilisé depuis plusieurs années. Cette
technologie évolue très vite mais reste délicate et ses indications doivent être posés lors d’une
consultation de génétique médicale.
Nous allons traiter deux techniques largement utilisées en diagnostic médical: la PCR et le
séquençage de l’ADN

II : REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR)
II-1 : PRINCIPE DE LA PCR
La PCR standard est une technique d’amplification in vitro. Elle permet d’amplifier
spécifiquement de façon exponentielle une séquence d’ADN, à partir d’une très petite quantité
de matériel, et faciliter ainsi son analyse.
La PCR standard est basée sur :
- L’action d’une ADN polymérase thermostable : la Taq polymérase.
- La connaissance des séquences flanquant l’ADN cible, ce qui permet de
synthétiser des amorces de 15 à 25 paires de bases. Ces amorces (ou primers)
seront, une fois hybridées à leurs séquences complémentaires respectives,
allongées dans les sens 5’ 3’
- La répétition pendant une trentaine de fois d’un cycle d’amplification fait de trois
étapes :
1- Une étape de dénaturation qui se fait généralement à 94°C et qui permet la
séparation des deux brins d’ADN
2- Une étape d’hybridation des amorces délimitant le fragment à amplifier. La
température d’hybridation est spécifique de chaque couple d’amorces.
L’hybridation est permise grâce à un abaissement de la température. Cette
étape est particulièrement importante, car elle conditionne la spécificité de
la réaction.
3- Une étape d’extension d’amorces à 72°C. Elle permet la synthèse des deux
nouveaux brins d’ADN par incorporation des 4 désoxynucléotides
triphosphates (dNTP)
- Chaque brin néo-synthétisé sert de matrice pour une nouvelle synthèse au cycle
suivant. Après n cycles on aura une amplification exponentielle de la séquence
d’ADN cible (2n copies où n représente le nombre de cycles effectués).

La PCR est donc une combinaison de réactions enzymatiques et de dénaturation physicochimique
par la chaleur. Elle permet de produire, en quelques heures, de grandes quantités de
l’ADN de la région à étudier. Cette quantité est suffisante pour être visualisée sous forme
d’une bande fluorescente directement par électrophorèse et après coloration au bromure
d’éthidium.